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科研進(jìn)展 | 陶亮課題組發(fā)現(xiàn)TMPRSS2不僅限“助攻”病毒感染還能介導(dǎo)索氏梭菌出血毒素的宿主入侵

索氏梭菌( Paeniclostridium sordellii )是一種產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌，可感染人和其他動(dòng)物引起組織壞死，腸毒血癥，敗血癥及中毒性休克等嚴(yán)重疾病。該細(xì)菌常見于環(huán)境中，并有一定幾率定植在人體腸道和女性生殖道中（約3-4%）。目前，索氏梭菌引發(fā)的急性感染病例總數(shù)不多但卻非常致命。約 74%的索氏梭菌急性感染發(fā)生在女性分娩或流產(chǎn)過程，致死率接近100%。

索氏梭菌毒力因子主要包括致死毒素 TcsL 和出血毒素 TcsH，這兩種毒素均屬于大梭菌毒素（ Large Clostridial Toxin, LCT ）家族，該家族其他成員還包括艱難梭菌產(chǎn)生的毒素 TcdA 和 TcdB，產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素 TpeL 以及諾維氏梭菌的毒素 Tcnα 等。TcsH 是該毒素家族中唯一細(xì)胞受體尚未闡明的重要成員，這在很大程度上阻礙了我們對(duì)其作用機(jī)理和發(fā)病機(jī)制的研究。

西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的陶亮課題組專注于細(xì)菌毒素對(duì)宿主細(xì)胞功能的影響和作用機(jī)制的研究，先后發(fā)現(xiàn)了毒素 TcdA, Tcnα, TcdB 等的多個(gè)宿主細(xì)胞受體，部分研究成果已發(fā)表在 Cell, Cell Research, Nature Microbiology 等期刊上。近日，陶亮課題組在該領(lǐng)域再次取得新的突破。

北京時(shí)間2022年7月26日，團(tuán)隊(duì)在 Nature Communications 上在線發(fā)表題為 “Paeniclostridium sordellii hemorrhagic toxin targets TMPRSS2 to induce colonic epithelial lesions” 的研究論文，首次揭示 TMPRSS2 是 TcsH 的腸上皮受體，填補(bǔ)了多年以來對(duì)出血毒素 TcsH 知之甚少的領(lǐng)域空白。

論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41467-022-31994-x

由于可參考的關(guān)于 TcsH 的先前研究相對(duì)稀少，團(tuán)隊(duì)在初期也遇到了不小的困難。其中一個(gè)難點(diǎn)就是合適的與毒素互作的靶向細(xì)胞的選擇。與其它 LCT 相比，TcsH 在很多常見細(xì)胞株上表現(xiàn)出來的毒性很弱。研究團(tuán)隊(duì)意識(shí)到篩選合適細(xì)胞系的重要性，于是測(cè)試了大量的不同組織來源的細(xì)胞系，多數(shù)人源細(xì)胞系對(duì) TcsH 都不敏感，但研究中也發(fā)現(xiàn)了兩株特定的細(xì)胞，人結(jié)腸癌細(xì)胞系 HT-29 和人結(jié)直腸癌細(xì)胞系 Caco-2，對(duì) TcsH 高度敏感?；谶@一發(fā)現(xiàn)，團(tuán)隊(duì)選取了 HT-29 細(xì)胞作為研究 TcsH 的模式細(xì)胞，并且為了提高成功率，選擇兩個(gè)不同來源的人源 sgRNA 文庫在 HT-29 細(xì)胞上構(gòu)建敲除文庫。通過 TcsH 壓力篩選，研究者們發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)獨(dú)立的篩選系統(tǒng)同時(shí)富集了一系列共同的靶向基因，包括跨膜絲氨酸蛋白酶2（TMPRSS2 ）及巖藻糖基化修飾相關(guān)基因 GMDS、SLC35C1、FUT4（圖1）。通過構(gòu)建基因突變和回補(bǔ)細(xì)胞，研究者們證明這些基因?qū)?TcsH 的細(xì)胞侵入起了重要作用。

圖1. CRISPR/Cas9介導(dǎo)的全基因組敲除篩選發(fā)現(xiàn)與TcsH作用相關(guān)的宿主基因

TMPRSS2 由于廣泛參與了包括流感、SARS、MERS 等在內(nèi)的多種病毒的細(xì)胞入侵而“臭名昭著”。TMPRSS2 參與病毒入侵的方式是通過其絲氨酸蛋白酶活性激活病毒的刺突蛋白，從而促進(jìn)膜融合。有意思的是，TMPRSS2 的絲氨酸蛋白酶活性與其介導(dǎo) TcsH 入侵完全無關(guān)（圖2）。另一方面，TMPRSS2 可以特異性地與 TcsH 進(jìn)行結(jié)合，親和力高達(dá)0.13 nM。說明與“助攻”病毒感染的模式不同，TMPRSS2 是作為直接的蛋白受體協(xié)助毒素 TcsH 入侵靶向細(xì)胞的。

圖3. TMPRSS2 高表達(dá)的細(xì)胞展現(xiàn)出對(duì)TcsH的高敏感性

另一方面，巖藻糖基化修飾廣泛存在于許多細(xì)胞表面，研究發(fā)現(xiàn)其與 TcsH 在細(xì)胞表面的結(jié)合密切相關(guān)。通過進(jìn)一步的生化和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括構(gòu)建敲除后補(bǔ)回實(shí)驗(yàn)、體外結(jié)合、競(jìng)爭(zhēng)拮抗等，研究者們證明了 TMPRSS2 和巖藻糖化的作用是相互獨(dú)立的，兩者可競(jìng)爭(zhēng)性地參與 TcsH 的細(xì)胞識(shí)別（圖4）。

圖4. TMPRSS2 和巖藻糖化多糖可作為TcsH兩類相互獨(dú)立的受體

最后，為進(jìn)一步探究 TMPRSS2 在生理和病理學(xué)上的意義，研究者們利用了一種 Tmprss2 全敲除的小鼠模型。腹腔注射毒素后發(fā)現(xiàn)，野生型（Tmprss2+/+）和雜合型（Tmprss2+/?）小鼠對(duì)TcsH的耐受性顯著低于純合型（Tmprss2?/?）小鼠。由于腸道是索氏梭菌定植的重要部位之一，且已知部分腸道上皮細(xì)胞有較高的 TMPRSS2 表達(dá)。后續(xù)研究者們利用野生型和 Tmprss2 敲除小鼠構(gòu)建腸道結(jié)扎模型，結(jié)果顯示 TcsH 處理后 Tmprss2 敲除小鼠結(jié)腸上皮損傷明顯小于野生型小鼠（圖5）。

圖5. 小鼠模型顯示TMPRSS2 是TcsH重要的病理相關(guān)受體

西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的陶亮研究員為本文通訊作者；陶亮課題組的博士研究生李星星和賀柳晴為共同第一作者；其他合作作者包括西湖大學(xué)的李顏顏博士，博士后羅建華，博士研究生鄭洋鈴、周瑤、李丹陽，及科研助理張媛媛和潘振瑞；此外還感謝西湖大學(xué)生科院的章永登研究員在熒光顯微攝影方面提供的幫助。本課題受到國家自然科學(xué)基金、西湖實(shí)驗(yàn)室（生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)浙江省實(shí)驗(yàn)室）及西湖教育基金會(huì)的資助；項(xiàng)目實(shí)施還得到了西湖大學(xué)生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的支持和幫助。

西湖大學(xué)微生物宿主交互實(shí)驗(yàn)室（實(shí)驗(yàn)室主頁鏈接：https://tao.lab.westlake.edu.cn/）致力于研究微生物-宿主之間的相互作用方式和內(nèi)在規(guī)律，尤其是從分子、生化、細(xì)胞、生信、結(jié)構(gòu)等方面研究重要病原細(xì)菌及其致病因子對(duì)宿主的影響及作用機(jī)制。

西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員陶亮近年來以通訊作者在 Cell、Cell Research、Nature Microbiology、Nature Communications、PLOS Pathogens 等學(xué)科主流期刊上發(fā)表多篇學(xué)術(shù)論文。實(shí)驗(yàn)室招收博士研究生，且有多個(gè)博士后、科研助理崗位，方向包括且不限于分子微生物學(xué)、生物信息學(xué)和微生物組學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等，誠邀各方青年才俊加入、攜手共同成長(zhǎng)！

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